La morfogenesi e la differenziazione fenotipica sono processi dipendenti dal tempo e dallo spazio: la plasticità morfologica, anziché essere il risultato di un "adattamento" genetico, riflette l'influenza dei parametri fisico-chimici esterni su qualsiasi sistema materiale ed è quindi una proprietà intrinseca, inevitabile degli organismi. L'impostazione fisica che integra la diversa sostanza chimica come segnali fisici che guidano le cellule e i tessuti verso la differenziazione è noto come "campo morfogenetico". All'interno di questo campo, i segnali morfogenetici esercitano influenze a breve e lungo raggio influenzando i gradienti dei morfogeni e le sollecitazioni meccaniche. Questo processo dipende fortemente dalla geometria del campo morfogenetico che governa la topologia dei segnali di segnalazione. In questo quadro, la forma geometrica acquisita da una cellula - vale a dire la sua forma - rappresenta il punto finale integrato dei segnali morfogenetici che agiscono sul sistema vivente: la morfogenesi è in effetti il processo attraverso il quale una popolazione di cellule si riorganizza in una forma distintiva . La microgravità esercita numerosi e rilevanti effetti sugli organismi viventi, a livello sia molecolare che sovramolecolare. Vale a dire, le cellule esposte alla microgravità mostrano cambiamenti architettonici e citoscheletrici, nonché profonde modifiche biochimiche e genetiche. Questi cambiamenti alla fine portano a compromissione delle funzioni biologiche e fallimento fisiologico. È stato suggerito che la modifica indotta dalla microgravità sulla struttura del citoscheletro (CSK) porta alla forma e ai successivi cambiamenti di espressione genica. Secondo tale ipotesi, un'ampia alterazione del profilo di espressione genica potrebbe essere considerata come conseguenza secondaria della riconfigurazione strutturale complessiva delle cellule favorita dalla microgravità. Tuttavia, tale correlazione non è stata ancora chiaramente stabilita. Oltre alla rilevanza teorica di tale relazione, la dipendenza dei cambiamenti genetici dalla stabilità strutturale della forma implica che stabilizzando il CSK alcuni effetti di microgravità potrebbero essere neutralizzati. Dato che la manipolazione sperimentale e farmacologica/nutrizionale del microambiente ha dimostrato di preservare il CSK e la conformazione della forma cellulare, si è tentati di ipotizzare se tali misure potrebbero contrastare efficacemente i cambiamenti relativi alla microgravità nel CSK e nella forma cellulare. Questo è lo scopo dell'indagine sulla forma e l'espressione delle cellule.

Le cellule tumorali al seno (MCF7) vengono seminate sia in un terreno di coltura di controllo (campione CTRL), sia in un terreno di coltura integrato con melatonina (campione trattato). Quest'ultimo mezzo, grazie alla capacità della melatonina di contrastare l'esposizione alla microgravità (la melatonina è un agente stabilizzante del CSK), rappresenterà un controllo simile alla contromisura per l'esperimento. MCF7 CTRL e MCF7 trattati con melatonina vengono coltivati sul campo di gravità normale (controllo a terra), nella microgravità simulata a terra (controllo della microgravità simulata) e a bordo dell'ISS (campo di microgravità reale).

Per gestire i campioni come richiesto, ogni CCI contiene una EU (Experiment Unit) ed è alimentata e le celle sono incubate a 37 ° C dal Kubik.

Esperimento sulla ISS: L'EU è progettata per consentire una coltura liquida di cellule placcate su un solido supporto. Le cellule vengono attivate, incubate, cresciute e fissate in modo completamente autonomo. L'EU rende possibili analisi sia sulle cellule (a livello citologico e molecolare), sia sui mezzi di crescita (potendo raccogliere il mezzo di crescita esaurito).

Preflight

Un laboratorio biologico accanto alla piattaforma di lancio è necessario per le operazioni preliminari sopra descritte. Le cellule vengono seminate in boccette convenzionali prima del loro inserimento nella CCI. Ventiquattro ore prima del lancio, le cellule (3x103 cellule/cm2) vengono seminate in ogni EU, a sua volta integrata nel contenitore sperimentale della CCI.

In-flight

Al massimo 24 ore dopo l'attracco, i campioni iniziano l'incubazione in Kubik a 37 ° C. Tutte le azioni richieste per i cambiamenti e la fissazione medi avvengono automaticamente.

Una volta iniziata l'incubazione, 2 campioni (ovvero 2 diverse EU, rispettivamente contenenti cellule in terreno di coltura di controllo o terreno di coltura aggiunto con melatonina) vengono fissati con T0 + 2h. Per ogni EU è necessario un primo lavaggio con tampone PBS, fissazione in NotoxHisto e un lavaggio finale in PBS per evitare un'eccessiva fissazione.

Questi campioni vengono conservati a + 4 ° C fino alla fine del volo, riponendo le CCI a bordo in un contenitore raffreddato e ritornando in “cold stowage”. Gli altri 6 campioni vengono conservati a Kubik per un'ulteriore incubazione (sempre a 37 ° C) per un massimo di 47 ore.

L'aggiornamento medio ha luogo nelle restanti 6 UE di T0 + 3h (l'aggiornamento viene eseguito in 3 EU con mezzo di coltura di controllo e in 3 terreni di coltura EU aggiunti con melatonina).

La fissazione si verifica nei 6 campioni rimanenti di T0 + 51h. Per ogni EU è necessario un primo lavaggio con tampone PBS, fissazione in NotoxHisto, lavaggio finale in PBS per evitare un'eccessiva fissazione.

Tutti questi campioni vengono conservati a + 4 ° C fino alla fine del volo riponendo la CCI a bordo in un contenitore raffreddato e ritornando in “cold stowage”.

Postflight

A terra le condizioni delle colture cellulari vengono valutate mediante microscopia ottica. I campioni fissati con NOTOXHisto sono trattati specificamente per studi di microscopia ottica e confocale. Le immagini acquisite vengono analizzate con metodi tecnici che misurano i profili di membrana nucleare e citoplasmatica di entrambe le singole cellule (energia di flessione normalizzata, NBE; Conteggio della scatola frattale; Lacunarity) e di gruppi di cellule (Analisi frattale ed entropia). Sui terreni di rifiuto, i test immunologici vengono utilizzati per rilevare fattori di crescita, enzimi e proteine come la ß-caseina (segno funzionale di differenziazione).

Il protocollo sopra descritto si applica anche a terra, in gravità e in microgravità simulata tramite Random Positioning Machine (RPM).